ADER 6.1.2 Faza I

Fundamentarea restricţiilor de coexistenţă pentru speciile agricole în funcţie de situarea geografică şi orografică a arealelor de cultură

 

Macheta 15

MACHETA 3

STAŢIUNEA DE CERCETARE DEZVOLTARE AGRICOLĂ

ŞIMNIC – CRAIOVA

Soseaua Bălceşti Nr. 54,Şimnic – Craiova, jud Dolj

Telefon/fax 0251/417534

E-mail: scdasimnic@yahoo.com

Nr.3135 din  12.12.2011

 

RAPORT DE ACTIVITATE AL FAZEI I

CONTRACT 612/2011

 

 

Identificatori

 

 1.Obiectivul proiectului:

 Determinarea condiţiilor de coexistenţă a speciilor agricole convenţionale şi modificate genetic în acelaşi agroecosistem pentru o corectă poziţionare geografică şi orografică a exploataţiilor agricole.

2.Rezultate preconizate pentru atingerea obiectivului:

- Alcătuirea unei baze de date cu privire la materialul genetic autohton, convenţional (linii consangvinizate, populaţii locale, hibrid zaharat de porumb) şi hibridul modificat genetic (MON 810) care vor fi cultivate în acelaşi agroecosistem;

- Stabilirea distanţelor de izolare a culturii de porumb modificat genetic (MON 810) faţă de cel convenţional;

- Stabilirea epocii optime de semănat în acelaşi agroecosistem a porumbului modificat genetic (MON 810) cu porumbul convenţional;

- Identificarea eventualului flux de gene între genotipuri diferenţiate fenotipic şi stabilirea nivelului de impurificare genică;

- Constituirea de noi genotipuri de porumb (transgenic) şi determinarea impactului lor asupra biodiversităţii la nivelul speciei Zea mays L.;

- Elaborarea unor norme şi metode de practică agricolă privind coexistenţa în cultură a porumbului modificat genetic cu cel convenţional şi diseminarea lor prin întâlniri cu specialiştii şi fermierii.

 

3.Obiectivul fazei:

Elaborarea sistemului experimental pentru realizarea obiectivelor generale şi specifice

4. Activităţi preconizate pentru atingerea obiectivului fazei:

 

5.Rezumatul fazei: (maxim 5 pagini) şi lucrarea "in extenso"

- activităţi efectuate/rezultate obţinute/costuri faţă de Planul de realizare propus.

 

1. CONDIŢIILE CLIMATICE ALE AREALULUI GEOGRAFIC ÎN CARE VOR FI AMPLASATE EXPERIENŢELE

Clima corespunzătoare zonei ecologice a SCDA Şimnic este caracteristică unei zone subumede cu ierni relativ blânde şi veri foarte călduroase.

Direcţia şi intensitatea vântului au caracteristicile impuse de relieful submontan şi deluros din partea de nord şi de câmpie din partea de sud a Olteniei.

În perioada de vegetaţie a porumbului  (aprilie – septembrie) intensitatea vântului prezintă valori medii, care se accentuează în zona de câmpie (lunca Dunării).

În general, direcţia vânturilor dominante este din nord şi nord-vest dar se înregistrează şi vânturi din est care cresc în frecvenţă şi intensitate în lunile de iarna  (decembrie, ianuarie şi februarie).

Temperatura

Temperatura medie anuală este de 10,8 – 110C.

Luna cea mai rece este ianuarie (temperatura medie – 30C) iar cea mai caldă este luna iulie (temperatura medie 230C). Temperaturile maxime vara în aer ating frecvent 400C, determinând temperaturi la sol uneori de peste 650C, cu blocaje fotosintetice înregistrate în cursul zilelor, cu insolaţii puternice. Fenomene de ofilire temporară se înregistrează la majoritatea culturilor agricole în lunile iulie – august.

Indicii anuali de ariditate au valori cuprinse între 25 şi 30. Există o perioadă secetoasă vara când indicii lunari scad sub 22, lunile iunie, iulie, august, septembrie.

Precipitaţii

Anual cad cca 540 – 550 l/mp precipitaţii, total neuniform repartizate în sezonul de vegetaţie.

Condiţii meteorologice specifice perioadei de vegetaţie a porumbului în anul agricol 2010 – 2011

Din punct de vedere climatic anul agricol 2010 – 2011 a fost un an puţin favorabil culturii porumbului în zona de sud a Olteniei. Rezerva de apă din sol din perioada rece a anului de + 132,08 l/mp a permis pregătirea patului germinativ şi înfiinţarea culturii de porumb în bune condiţii .

Semănatul s-a făcut în a doua jumătate a lunii aprilie – prima decadă a lunii mai, când a căzut o cantitate mică de precipitaţii, comparativ cu multianuala zonei (- 24,5 l/mp – în aprilie şi – 9,8 l/mp în mai – Tabel 1), dar suficientă pentru germinarea seminţelor şi răsărirea plantelor.

Deficitul de umiditate s-a menţinut atât în perioada de formare a elementelor de producţie (mai – iunie) cât şi la polenizare. Singura lună în care s-a înregistrat un plus de 27,4 l/mp a fost luna iulie dar numai datorită precipitaţiilor căzute în ultima decadă, când polenizarea şi fecundarea s-au încheiat.

Lipsa precipitaţiilor din luna august (numai 8,0 l/mp în prima decadă) a dus la şiştăvirea boabelor şi implicit la diminuarea producţiei.

Temperatura medie lunară a fost sub normala ultimilor 15 ani pe toată perioada de vegetaţie a porumbului. Luna septembrie a fost foarte călduroasă (+3,90C – faţa de multianuala zonei) şi lipsită de precipitaţii ducând la coacerea prematură a porumbului.

În astfel de condiţii producţia medie  obţinută la porumb în anul 2011 a fost de 6000 – 8000 kg boabe/ha.

În general, în zona de influenţă a SCDA Şimnic condiţiile climatice sunt specifice unui areal secetos, din 10 ani numai 2 fiind favorabili culturii porumbului.   

Tabel 1

DATE METEO PENTRU PERIOADA DE VEGETAŢIE LA PORUMB

ÎN ANUL AGRICOL 2010 - 2011 LA S.C.D.A ŞIMNIC

 

 

 

 


2. FONDUL DE GERMOPLASMĂ UTILIZAT ÎN REALIZAREA EXPERIENŢELOR

Pentru realizarea experienţelor prevăzute în Planul de realizare al proiectului ADER 6.1.2. vor fi utilizate următoarele genotipuri de porumb: - Lc A188 – linie consangvinizată de porumb de provenienţă străină (America) ce se află în colecţia de germoplasmă a laboratorului de ameliorare de la SCDA Şimnic din anul 1995.

A fost înmulţită sub izolator (pentru menţinerea purităţii genetice) mai mulţi ani la rând, în condiţii de câmp specifice arealului de influenţă a SCDA Şimnic. Este o linie care prezintă un decalaj mai mare între înflorit şi mătăsit (comparativ cu liniile autohtone) dar reuşeşte să asigure o cantitate suficientă de polen (înfloritul durează mai mult), astfel încât să se obţină ştiuleţi bine acoperiţi. Are bobul alb (yy), caracter bine stabilizat, cu transmitere ereditară care va fi utilizat ca indicator biologic pentru determinarea indirectă a fluxului de gene de la porumbul modificat genetic MON 810 către porumbul convenţional.

- P35 – populaţie locală de porumb din zona Novaci

- P 285 – populaţie locală de porumb din zona Vâlcea

Două populaţii locale de porumb colectate din zona Olteniei şi care fac parte din colecţia de germoplasmă a SCDA Şimnic, fiind bine adaptate arealului geografic.

Au o talie înaltă şi emit o cantitate suficientă de polen în perioada înfloritului astfel încât se obţine un număr mare de boabe pe ştiulete.

Caracteristicile distinctive ale acestor două populaţii sunt: bob sticlos de tip indurat şi culoarea bobului galben-portocalie. Aceste caractere vor fi utilizate în experimentele noastre pentru determinarea numărului de xenii (apărute prin cultivarea acestor populaţii în imediata apropiere a porumbului modificat genetic MON 810). Astfel, vom putea determina (indirect) nivelul de impurificare genică a unei culturi de porumb convenţional cultivată în acelaşi areal geografic cu o cultură de porumb modificat genetic.

- 1 hibrid de porumb zaharat (su1 su1), utilizat tocmai pentru caracteristica bobului (zbârcit), ca indicator biologic de monitorizare a fluxului de gene (de la porumbul modificat genetic MON 810 către porumbul convenţional) şi pentru determinarea nivelului de impurificare genică.

- hibridul de porumb MON 810 (aparţinând companiei Monsanto), cu gena Bt ce conferă rezistenţă la sfredelitorul european al porumbului  (Ostrinia nubilalis).

Va fi utilizat în toate variantele experimentale ca OMG.

 

3. PROTOCOLUL DE CERCETARE (metode, tehnici de lucru, analize în câmp şi laborator)

Pentru realizarea obiectivelor generale şi specifice ale proiectului ADER 6.1.2. se va cultiva porumb modificat genetic (MON 810) în acelaşi agroecosistem (arealul de influenţă a SCDA Şimnic) cu porumb convenţional.

FAZA II– anul 2012

Semănatul se va face simultan (porumbul modificat genetic MON 810 va fi semănat în aceeeaşi zi cu porumbul convenţional).

Vor fi organizate 5 experienţe astfel:

1. - Un dreptunghi de 630 mp în care porumbul modificat genetic (MON 810) se află în centru fiind înconjurat de porumb convenţional (linia A 188, cu bob alb – în imediata apropiere a acestuia).

2. -  Un dreptunghi – 630 mp – în care porumbul convenţional (două populaţii locale de porumb – (P32 şi P 285) se află în centru fiind înconjurat de MON 810, în imediata apropiere a acestuia,

3. - 1 experienţă de 1900mp în care porumbul convenţional va fi semănat la diferite distanţe (10; 20; 30m) faţă de porumbul modificat genetic.

4. -1 experienţă de 4560 mp în care un dreptunghi semănat cu porumb zaharat va fi  între două benzi de porumb modificat genetic (MON 810) la distanţă de 100m de acesta.

5. – 1 experienţă de 4740 mp în care porumbul zaharat va fi semănat între două benzi de porumb MON810 situate la 100m de acesta, cu benzi de protecţie la jumătatea distanţei de izolare.

De asemenea se vor semăna parcele mici de înmulţire a liniei consangvinizate A 188 şi a celor două populaţii (P32; P285) pentru a asigura sămânţa ce va fi utilizată în anul 2013.

Se va înfiinţa un minilot de hibridare F376 pentru a urmări coincidenţa la înflorit a formelor parentale (mai ales forma mamă) cu MON 810, rezultate ce vor fi utilizate în anul 2014 când porumbul modificat genetic va fi amplasat la  diferite distanţe de izolare faţă de un lot de hibridare.

FAZA III – anul 2013

Se reia modelul de amplasare a experienţelor din anul 2012 cu deosebirea că semănatul porumbului modificat genetic şi a celui convenţional se va face decalat în funcţie de notările şi determinările din anul anterior astfel încât să existe coincidenţă la înflorit a celor 2 sau 3 genotipuri ce alcătuiesc fiecare experienţă.

În astfel de condiţii potenţialul de polenizare încrucişătă este mai mare, asigurând intensificarea fluxului de gene între genotipurile fiecărei experienţe.

FAZA IV – anul 2014

Experienţele vor fi amplasate pe un câmp mai mare aparţinând unei ferme de producţie a SCDA Şimnic.

1. – 1 experienţă de 50.000 mp în care o suprafaţă de 1750 mp semănată cu MON 810 va fi înconjurată de porumb de consum (în imediata apropiere),

În parcela cu porumb de consum se vor stabili 10 puncte de observaţie (x 2 repetiţii) situate la 150; 200; 300; 400; 450 m de o parte şi alta a câmpului MON 810, de unde vor fi recoltate probe pentru analiza ADN.

2. – 1 experienţă de 30.000 mp în care la o distanţă de 150; 200; 300; 400 şi 450 m de o parte şi de alta a unei suprafeţe cultivată cu MON 810 se vor amplasa miniloturi de hibridare F376 (în câmp deschis).

Se va asigura coincidenţa la înflorit a formelor parentale cu Mon 810 (dacă este necesar), prin decalarea semănatului, pe baza observaţiilor obţinute în primul an de experimentare.

Din fiecare minilot (10 puncte de observaţie x 2 rep.) vor fi recoltate probe de seminţe pentru analiza ADN.

În paralel, în câmpul de cercetare al laboratorului de ameliorare, se va înfiinţa o microcultură (1 genotip/rând) cu genotipurile nou create din xeniile obţinute în primii doi ani de experimentare  ( 1 genotip = xeniile recoltate de pe un rând cultivat cu porumb convenţional).

În condiţii de câmp:

În primii doi ani de experimentare se vor face notări pentru:

- vigoarea de creştere a plantelor (în primele faze de vegetaţie) – prin note de la 1 la 9 unde  (1 – foarte slab;  9 – foarte bun);

- perioada de vegetaţie pe fenofaze: - dată înflorit

                                                          - dată mătăsit

                                                          - dată maturitate fiziologică

- număr frunze/ plantă;

- culoare frunză;

- culoare panicul;

- culoare mătase;

- rezistenţa la secetă (note de la 1 la 9 unde 1 = foarte sensibil; 9 = rezistent);

- rezistenţa la frângere şi cădere (note de la 1 la 9 unde 1 = foarte sensibil; 9 = rezistent);

- înălţime totală plantă;

- înalţime de inserţie a ştiuletelui principal;

- fuzarioza ştiuletelui (note de la 1 la 9 unde 1 = foarte sensibil; 9 = rezistent);

- atacul sfredelitorului porumbului (Ostrinia nubilalis), pentru porumbul convenţional, prin determinarea frecvenţei de atac (după formula: F = n x 100  unde n = nr. plante atacate şi N  = nr total de plante evaluate).

                                                                N

În laborator

La recoltare se va determina:

- lungimea ştiuletelui;

- număr de rânduri de boabe;

- convarietatea;

- culoarea bobului;

- greutatea boabelor pe ştiulete;

- masa a 1.000 de boabe;

- conţinutul de proteină şi grăsimi din bob;

- umiditatea boabelor la recoltare;

- capacitatea de producţie a fiecărui genotip.

Aceleaşi determinări şi notări se vor realiza şi pentru genotipurile nou create (obţinute în fazele II şi III, care vor fi cultivate în faza IV) pentru a putea face o comparaţie între caracterele părinţilor şi ale noilor genotipuri transgenice.

Pentru monitorizarea fluxului de gene prin intermediul polenului se va determina numărul de boabe xeniate raportat la numărul de boabe / ştiulete pentru a afla % de xenii.

Fiecare rând semănat cu porumb convenţional va reprezenta o variantă experimentală.

Se va stabili nivelul de impurificare genică a porumbului convenţional în funcţie de distanţa de izolare faţă de porumbul modificat genetic (MON 810), de epoca de semănat, direcţia şi intensitatea vântului, umiditatea atmosferică în perioada înfloritului.

Pentru determinarea directă a nivelului de impurificare genică cu porumb MON 810 se va face analiza imunologică a probelor de porumb convenţional prin metoda ELISA [kit „Bt Maize test”, Strategic Diagnostics Inc. (Nevada, SUA)] prin detecţia şi cuantificarea proteinei Cry 1Ab.

Kitul „Bt Maize test” detectează proteina Cry 1Ab produsă de o genă derivată din Bacillus thuringiensis (Bt). Această genă poate fi încorporată în porumbul rezistent la atacul insectelor, inclusiv YieldGard® de la Monsanto (MON 810).

Kit-ul a fost dezvoltat pentru a identifica această proteină în fracţiile alimentare de porumb procesat, precum şi făinuri, alimente, tărâţe şi gluten. Fiecare kit conţine standarde de calibrare, care includ un control negativ şi 3 standarde de referinţă pozitive, cu un procent etichetat de făină de porumb YieldGard® (MON 810).

Descriere metodă de lucru

  1. Măcinarea şi sitarea probelor de porumb

- Se macină întreaga cantitate de probă dintr-o pungă sigilată (500g), până la obţinerea unei pulberi omogene. Utilizarea morii Retsch (18.000 rpm, sita de 1 mm) se face conform IL M12 şi se notează în caietul CM 19.

- Din proba măcinată se obţine contraproba, prin introducerea unei cantităţi într-un tub Falcon (50ml), care se introduce în congelator (- 180C). Contraproba se utilizează pentru repetarea analizelor sau în caz de litigii şi se menţine în congelator timp de 1 an.

- Se sitează pulberea rezultată printr-o sită cu ochiuri de 120 µm. Sitarea probei se notează în caietul CM 19.

- Se colectează pulberea cernută pentru a fi utilizată în procedura de extracţie, fiind necesare cel puţin 2 g/probă.

2.  Pregătire reactivi

Înainte de utilizare, toţi reactivii trebuie să fie aduşi la temperatura camerei (240C). Pentru fiecare ciclu de analiză este obligatoriu să fie utilizat un nou set de standarde de calibrare şi probe martor. Ambalajul se închide întotdeauna după extragerea stripurilor acoperite cu proteina Cry 1Ab în vederea efectuării testului.

3. Prepararea tamponului diluat, care se foloseşte atât pentru extracţia proteinei Cry 1Ab, cât şi pentru spălarea plăcii ELISA:

- Se lasă tamponul concentrat (10x) să ajungă la temperatura camerei

- Se diluează tamponul concentrat (10x) în apă bidistilată pentru a prepara tamponul porumb Bt.

4. Procedura de extracţie a proteinei Cry 1Ab

- Se cântăresc câte 1,0 g (±0,05g) pentru standardele de calibrare şi proba necunoscută şi 0,1 g (±0,001g) pentru materialele de referinţă certificate (CRM) (IL M21; CM 20).

- Se pipetează 4,0 ml tampon diluat în tubul conţinând 1,0 g probă şi standarde de calibrare şi 0,4 ml tampon diluat în tubul conţinând 0,1g CRM; se vortexează pentru 2 minute, după care tuburile se lasă în repaus timp de 5 min;

- Tuburile se centrifughează la aprox. 5.000 rpm, la 40C, timp de 5 min. (IL M13; CM 21)

Mod de lucru

Încercarea testului ELISA se efectuează de către Responsabilii de încercare şi se înregistrează în CM 23.1

-Pipetarea probelor 

- Extractele (100 μl) se pipetează după cum urmează : standarde de calibrare – în 3 godeuri pentru fiecare nivel, fiecare probă de analizat – în 2 godeuri, CRM – în 2 godeuri pentru fiecare nivel, proba blank (tampon diluat) – în două godeuri. Se acoperă placa cu Parafilm pentru a preveni contaminarea şi evaporarea.

- Incubarea stripurilor la temperatura camerei (240C), pentru 1 oră (CRM 23.1)

- Ciclul de spălare – se spală placa cu spălătorul automat Columbus, de 4 ori cu tampon diluat (300 μl/godeu) (IL M15; CM 22)

- Adaos Conjugat -1 Porumb Bt – se adaugă 100 μl conjugat – 1 porumb în fiecare godeu acoperit cu proteina de porumb. Se acoperă placa cu Parafilm pentru a preveni evaporarea.

 - Incubarea Conjugat-1 porumb - Se incubează stripurile la 240C, timp de 1 ora (CM 23.1).

- Ciclul de spălare - Se spală placa, cu spălătorul automat, de 4 ori cu tampon diluat (300 μl/godeu)  (IL M15; CM 22).

- Adaos Conjugat-2 porumb - Se adaugă 100 µl conjugat-2 porumb în fiecare godeu acoperit cu proteina   din porumb. Se acoperă placa cu Parafilm pentru a preveni contaminarea şi evaporarea.

- Incubarea Conjugat-2 porumb - Se incubează stripurile la 240C, timp de 45 min (CM 23.1).

- Ciclul de spălare - Se spală placa, cu spălătorul automat, de 4 ori cu tampon diluat (300 μl/godeu)                                       (IL M15; CM 22).

- Dezvoltarea culorii - Se adaugă 100 μl de reactiv de culoare în fiecare godeu acoperit cu proteină din porumb Bt şi se incubează la 240C, timp de 20 min (CM 23.1).

- Stopare reacţie. După 20 minute de incubare, se stopează reacţia, prin adăugarea a 100 μl de reactiv de stopare în fiecare godeu acoperit cu proteina Bt, în aceeaşi succesiune în care a fost adaugat reactivul de culoare (CM 23.1).

- Citire absorbantă (densitatea optică, DO). Se citeşte absorbanta culorii dezvoltate la 450 nm, prin utilizarea spectrofotometrului automat Sunrise, echipat cu softul Magellan (IL M14; CM 22).

- Concentraţiile de proteină Cry1Ab calculate automat pe baza absorbantelor citite se înregistrează in CM 23.1.

- Raportul electronic se printează, se semnează de către analiştii care au participat la testare şi se ataşează  la CM 23.1.

        Exprimarea rezultatelor

- Recuperarea calculată pentru concentraţia proteinei Cry1Ab în CRM se aplică pentru concentraţia   de proteină determinată în probele de analizat, obţinându-se concentraţia corectată pentru recuperare.

                - Rezultatele se exprimă ca % de impurificare cu porumb MON 810 (ex. 0,3 % porumb MON 810 =  3,0 g porumb MON 810 / kg porumb).

                   - Probele care prezintă o valoare apropiată de ‘’pragul de etichetare’’ de 0,3 % porumb MON 810  se reanalizează pe 3 extracţii şi se aplică coeficientul de variaţie (CV, %). Dacă se obţin din nou, valori apropiate de valoarea ‘’pragului de etichetare’’, se recomandă testarea probei prin metoda RT – PCR. 

                 - Rezultatele se înregistrează în CM 23.1 - Caiet responsabil analize (ELISA - OMG) şi CM24 – Evidenţă încercări (ELISA).

                - Echipamentele, reactivii şi materialele utilizate pentru încercare trebuie să fie cele din Fişa de definire a încercărilor.

       Stadiul realizării proiectului;

                Din punct de vedere ştiinţific până în prezent prioetul ADER 6.1.2. s-a desfăşurat conform Planului de realizare anexat Contractului 612/2011.

În primăvara anului 2012 vor fi demarate activităţile de înfiinţare a experienţelor în condiţii de câmp, conform primelor activităţi ale fazei a-II-a de execuţie.

 

              DIRECTOR,                                                                                      

Prof.univ.dr. GĂVAN CONSTANTIN                                                        

 

CONTABIL ŞEF

Dr. ec. PĂTRU CLAUDIA    

 

DIRECTOR DE PROIECT

Dr. biolog URECHEAN  VIORICA

 

Comments